染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（Chromatin Immunoprecipitation，簡(jiǎn)稱ChIP）是研究體內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA相互作用的一種技術(shù)。它利用抗原抗體的特異性反應(yīng)，可以真實(shí)地反映體內(nèi)蛋白分子與基因組DNA結(jié)合的狀況。下面我們就zui基本的實(shí)驗(yàn)步驟，實(shí)驗(yàn)中的小技巧以及需要注意的問(wèn)題簡(jiǎn)單介紹一下。

1.  細(xì)胞固定

    甲醛能有效的使蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)-DNA，蛋白質(zhì)-RNA交聯(lián)，形成生物復(fù)合體，防止細(xì)胞內(nèi)組分的重新分布。交聯(lián)所用的甲醛終濃度為1%，交聯(lián)時(shí)間通常為5分鐘到1個(gè)小時(shí)。需注意的是，交聯(lián)時(shí)間如果過(guò)長(zhǎng)，細(xì)胞染色質(zhì)難以用超聲波破碎，影響ChIP結(jié)果，而且實(shí)驗(yàn)材料也容易在離心過(guò)程中丟失。交聯(lián)時(shí)間如果過(guò)短，則交聯(lián)不*，產(chǎn)生假陰性。甲醛的交聯(lián)反應(yīng)可被加入的甘氨酸終止。

2.  染色質(zhì)片段化

    交聯(lián)后的染色質(zhì)需被超聲波切成400~600bp的片段，以便目的蛋白的暴露，利于抗體識(shí)別，其片段破碎的均勻一致性對(duì)結(jié)果影響至關(guān)重要。傳統(tǒng)的超聲波破碎是利用機(jī)械力斷裂染色質(zhì)，容易引起升溫或產(chǎn)生泡沫，這都會(huì)引起蛋白質(zhì)變性，進(jìn)而影響ChIP的效率。而來(lái)自比利時(shí)的Bioruptor非接觸式超聲波破碎儀采用溫和的破碎方式，保證了蛋白的活性，DNA破碎效果均一，同時(shí)外接水循環(huán)儀保證了實(shí)驗(yàn)的溫度穩(wěn)定性，成為目前ChIP實(shí)驗(yàn)的。

3.  染色質(zhì)免疫沉淀反應(yīng)

Input對(duì)照：

在進(jìn)行免疫沉淀前，需要取一部分?jǐn)嗔押蟮娜旧|(zhì)做Input對(duì)照。Input需要與沉淀后的樣品DNA一起經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)交聯(lián)，DNA純化，以及zui后的檢測(cè)。Input對(duì)照不僅可以驗(yàn)證染色質(zhì)斷裂的效果，還可以根據(jù)Input中的靶序列的含量以及染色質(zhì)沉淀中的靶序列的含量，按照取樣比例換算出ChIP的效率，所以Input對(duì)照是ChIP實(shí)驗(yàn)*的步驟。

Beads選擇：

接下來(lái)，利用目的蛋白質(zhì)的特異抗體通過(guò)抗原-抗體特異反應(yīng)形成DNA-蛋白質(zhì)-抗體復(fù)合物，然后使用Agarose beads或Magnabeads沉淀此復(fù)合物，特異性地富集與目的蛋白結(jié)合的DNA片段。再經(jīng)過(guò)多次洗滌，除去非特異結(jié)合的染色質(zhì)后，用SDS+NaHCO3洗脫免疫沉淀復(fù)合物。

抗體選擇：

染色質(zhì)免疫沉淀所選擇的目的蛋白的抗體是ChIP實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。因?yàn)樵诘鞍踪|(zhì)與染色質(zhì)交聯(lián)結(jié)合時(shí)，抗體的抗原表位可能因?yàn)榕c結(jié)合位點(diǎn)的距離太近，不能被抗體識(shí)別，所以不能有效地在體內(nèi)形成免疫沉淀復(fù)合物，直接影響ChIP的結(jié)果。

陰性對(duì)照設(shè)置：

在做ChIP實(shí)驗(yàn)時(shí)，需設(shè)置對(duì)照，以便于對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性進(jìn)行評(píng)估。陽(yáng)性抗體和陰性抗體對(duì)照是zui基本的實(shí)驗(yàn)對(duì)照。陽(yáng)性抗體通常選擇與已知序列相結(jié)合的比較保守的蛋白的抗體，常用的包括組蛋白抗體或RNAPolymerase II抗體等。陰性抗體通常選擇目的蛋白抗體宿主的IgG或血清。目的蛋白抗體的結(jié)果與陽(yáng)性抗體和陰性抗體的結(jié)果相比較，才能得出正確結(jié)論。另外，還應(yīng)考慮目的蛋白抗體與DNA的非特異性結(jié)合的可能，所以通常還會(huì)選擇一對(duì)陰性引物，即目的蛋白肯定不會(huì)結(jié)合的DNA序列，作為該抗體的陰性對(duì)照。*的陰性對(duì)照引物是在靶序列上游的一段與目的蛋白肯定不能結(jié)合的序列。如果目的蛋白沒(méi)有商品化的適用于染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的抗體，只有其他用途的抗體時(shí)，可以先做蛋白質(zhì)免疫沉淀檢測(cè)。如果抗體可以成功的沉淀蛋白，再進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)。

4.  交聯(lián)反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)和DNA的純化

用不含DNase的RNase和Proteinase K，65℃保溫6小時(shí)逆轉(zhuǎn)交聯(lián)，經(jīng)DNA純化柱回收DNA或用酚氯仿抽提、乙醇沉淀純化DNA。在逆轉(zhuǎn)交聯(lián)時(shí)不使用Proteinase K，然后用丙酮回收有機(jī)相中的蛋白質(zhì)，進(jìn)行分析。

5.  DNA的鑒定

zui常用的DNA的鑒定方法是半定量PCR和Real-time PCR。由于啟動(dòng)子區(qū)域序列多樣性的特點(diǎn)，所以不同的細(xì)胞系或不同的動(dòng)物品系的同一基因的啟動(dòng)子序列有可能不同，因此可設(shè)計(jì)多對(duì)引物來(lái)反復(fù)驗(yàn)證ChIP實(shí)驗(yàn)的結(jié)果.

慧穎細(xì)胞庫(kù)400種類細(xì)胞株細(xì)胞系，20多株耐藥株，超低折扣，種類涵蓋：成纖維細(xì)胞 長(zhǎng)尾綠猴胚胎細(xì)胞 長(zhǎng)尾綠猴腎細(xì)胞 小鼠乳腺癌細(xì)胞 人膀胱癌細(xì)胞 人T細(xì)胞白血病細(xì)胞 人腎細(xì)胞腺癌細(xì)胞 人腎透明細(xì)胞腺癌細(xì)胞 人甲狀腺癌細(xì)胞 卵巢癌細(xì)胞 干細(xì)胞 結(jié)腸癌細(xì)胞 胃癌細(xì)胞 乳腺類細(xì)胞 等

以下為購(gòu)買細(xì)胞系后的售后小知識(shí)：

1、CO2 培養(yǎng)箱之水盤如何保持清潔？

定期（至少每?jī)芍芤淮危?以無(wú)菌蒸餾水或無(wú)菌去離子水更換之。

2、為何培養(yǎng)基保存于4 ℃ 冰箱中， 顏色會(huì)偏暗紅色， 且pH值會(huì)越來(lái)越偏堿性？

培養(yǎng)基保存于4 ℃ 冰箱中， 培養(yǎng)基內(nèi)之CO2 會(huì)逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來(lái)越偏堿性。而培養(yǎng)基中之酸堿指示劑（通常為phenol red） 的顏色也會(huì)隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿之結(jié)果， 將造成細(xì)胞生長(zhǎng)停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時(shí)， 可以通入無(wú)菌過(guò)濾之CO2， 以調(diào)整pH 值。

3、各種細(xì)胞培養(yǎng)用的dish，flask是否均相同？

不同廠牌的dish 或flask， 其所coating 的polymer 不同， 制造程序亦不同， 雖對(duì)大部分細(xì)胞沒(méi)有太大之影響， 惟少數(shù)細(xì)胞則可能因使用廠牌不同之dish 或flask 而有顯著之生長(zhǎng)差異。

4、購(gòu)買之細(xì)胞冷凍管經(jīng)解凍后，為何會(huì)發(fā)生細(xì)胞數(shù)目太少之情形？ 購(gòu)買之細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活率不佳可能原因？

研究人員在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)存活率不佳， 常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯(cuò)誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳。血清使用錯(cuò)誤或血清的品質(zhì)不佳。解凍過(guò)程錯(cuò)誤。冷凍細(xì)胞解凍后， 加以洗滌細(xì)胞和離心。懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞。培養(yǎng)溫度使用錯(cuò)誤。細(xì)胞置于–80℃太久。

慧穎生物熱賣細(xì)胞代號(hào)：OVCAR-5細(xì)胞，IMR-90細(xì)胞，A2780細(xì)胞，A2780/DDP細(xì)胞，SH-SY-5Y細(xì)胞，A431細(xì)胞，L Wnt-3A細(xì)胞，WRO細(xì)胞，IOSE80細(xì)胞，SW48細(xì)胞，COV434細(xì)胞，KGN細(xì)胞，SUM229PE細(xì)胞，SUM159PT細(xì)胞，SHIN3細(xì)胞，NCM460細(xì)胞，HFF細(xì)胞，HTR8-SVNEO細(xì)胞，MLE-12細(xì)胞，RS4：11細(xì)胞，HELF細(xì)胞，MRTEC細(xì)胞，HT-3細(xì)胞，LNCAP細(xì)胞，RAW264.7細(xì)胞等。

染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（Chromatin Immunoprecipitation，簡(jiǎn)稱ChIP）是研究體內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA相互作用的一種技術(shù)。它利用抗原抗體的特異性反應(yīng)，可以真實(shí)地反映體內(nèi)蛋白分子與基因組DNA結(jié)合的狀況。下面我們就zui基本的實(shí)驗(yàn)步驟，實(shí)驗(yàn)中的小技巧以及需要注意的問(wèn)題簡(jiǎn)單介紹一下。

1.  細(xì)胞固定

    甲醛能有效的使蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)-DNA，蛋白質(zhì)-RNA交聯(lián)，形成生物復(fù)合體，防止細(xì)胞內(nèi)組分的重新分布。交聯(lián)所用的甲醛終濃度為1%，交聯(lián)時(shí)間通常為5分鐘到1個(gè)小時(shí)。需注意的是，交聯(lián)時(shí)間如果過(guò)長(zhǎng)，細(xì)胞染色質(zhì)難以用超聲波破碎，影響ChIP結(jié)果，而且實(shí)驗(yàn)材料也容易在離心過(guò)程中丟失。交聯(lián)時(shí)間如果過(guò)短，則交聯(lián)不*，產(chǎn)生假陰性。甲醛的交聯(lián)反應(yīng)可被加入的甘氨酸終止。

2.  染色質(zhì)片段化

    交聯(lián)后的染色質(zhì)需被超聲波切成400~600bp的片段，以便目的蛋白的暴露，利于抗體識(shí)別，其片段破碎的均勻一致性對(duì)結(jié)果影響至關(guān)重要。傳統(tǒng)的超聲波破碎是利用機(jī)械力斷裂染色質(zhì)，容易引起升溫或產(chǎn)生泡沫，這都會(huì)引起蛋白質(zhì)變性，進(jìn)而影響ChIP的效率。而來(lái)自比利時(shí)的Bioruptor非接觸式超聲波破碎儀采用溫和的破碎方式，保證了蛋白的活性，DNA破碎效果均一，同時(shí)外接水循環(huán)儀保證了實(shí)驗(yàn)的溫度穩(wěn)定性，成為目前ChIP實(shí)驗(yàn)的。

3.  染色質(zhì)免疫沉淀反應(yīng)

Input對(duì)照：

在進(jìn)行免疫沉淀前，需要取一部分?jǐn)嗔押蟮娜旧|(zhì)做Input對(duì)照。Input需要與沉淀后的樣品DNA一起經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)交聯(lián)，DNA純化，以及zui后的檢測(cè)。Input對(duì)照不僅可以驗(yàn)證染色質(zhì)斷裂的效果，還可以根據(jù)Input中的靶序列的含量以及染色質(zhì)沉淀中的靶序列的含量，按照取樣比例換算出ChIP的效率，所以Input對(duì)照是ChIP實(shí)驗(yàn)*的步驟。

Beads選擇：

接下來(lái)，利用目的蛋白質(zhì)的特異抗體通過(guò)抗原-抗體特異反應(yīng)形成DNA-蛋白質(zhì)-抗體復(fù)合物，然后使用Agarose beads或Magnabeads沉淀此復(fù)合物，特異性地富集與目的蛋白結(jié)合的DNA片段。再經(jīng)過(guò)多次洗滌，除去非特異結(jié)合的染色質(zhì)后，用SDS+NaHCO3洗脫免疫沉淀復(fù)合物。

抗體選擇：

染色質(zhì)免疫沉淀所選擇的目的蛋白的抗體是ChIP實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。因?yàn)樵诘鞍踪|(zhì)與染色質(zhì)交聯(lián)結(jié)合時(shí)，抗體的抗原表位可能因?yàn)榕c結(jié)合位點(diǎn)的距離太近，不能被抗體識(shí)別，所以不能有效地在體內(nèi)形成免疫沉淀復(fù)合物，直接影響ChIP的結(jié)果。

陰性對(duì)照設(shè)置：

在做ChIP實(shí)驗(yàn)時(shí)，需設(shè)置對(duì)照，以便于對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性進(jìn)行評(píng)估。陽(yáng)性抗體和陰性抗體對(duì)照是zui基本的實(shí)驗(yàn)對(duì)照。陽(yáng)性抗體通常選擇與已知序列相結(jié)合的比較保守的蛋白的抗體，常用的包括組蛋白抗體或RNAPolymerase II抗體等。陰性抗體通常選擇目的蛋白抗體宿主的IgG或血清。目的蛋白抗體的結(jié)果與陽(yáng)性抗體和陰性抗體的結(jié)果相比較，才能得出正確結(jié)論。另外，還應(yīng)考慮目的蛋白抗體與DNA的非特異性結(jié)合的可能，所以通常還會(huì)選擇一對(duì)陰性引物，即目的蛋白肯定不會(huì)結(jié)合的DNA序列，作為該抗體的陰性對(duì)照。*的陰性對(duì)照引物是在靶序列上游的一段與目的蛋白肯定不能結(jié)合的序列。如果目的蛋白沒(méi)有商品化的適用于染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的抗體，只有其他用途的抗體時(shí)，可以先做蛋白質(zhì)免疫沉淀檢測(cè)。如果抗體可以成功的沉淀蛋白，再進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)。

4.  交聯(lián)反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)和DNA的純化

用不含DNase的RNase和Proteinase K，65℃保溫6小時(shí)逆轉(zhuǎn)交聯(lián)，經(jīng)DNA純化柱回收DNA或用酚氯仿抽提、乙醇沉淀純化DNA。在逆轉(zhuǎn)交聯(lián)時(shí)不使用Proteinase K，然后用丙酮回收有機(jī)相中的蛋白質(zhì)，進(jìn)行分析。

5.  DNA的鑒定

zui常用的DNA的鑒定方法是半定量PCR和Real-time PCR。由于啟動(dòng)子區(qū)域序列多樣性的特點(diǎn)，所以不同的細(xì)胞系或不同的動(dòng)物品系的同一基因的啟動(dòng)子序列有可能不同，因此可設(shè)計(jì)多對(duì)引物來(lái)反復(fù)驗(yàn)證ChIP實(shí)驗(yàn)的結(jié)果.

慧穎生物供應(yīng)ATCC細(xì)胞，癌細(xì)胞，干細(xì)胞，植物細(xì)胞，國(guó)產(chǎn)細(xì)胞，*的atcc細(xì)胞，atcc傳代細(xì)胞，sciencell細(xì)胞，sciencell原代細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，原代細(xì)胞培養(yǎng)，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)，植物細(xì)胞培養(yǎng)提供者。提供400多種類細(xì)胞株細(xì)胞系，20多株穩(wěn)定耐藥株，*，質(zhì)量穩(wěn)定，細(xì)胞飽滿，立體感強(qiáng)，活力強(qiáng)，傳代次數(shù)少，*！

細(xì)胞凍存是細(xì)胞培養(yǎng)的重要環(huán)節(jié)之一。利用凍存技術(shù)將細(xì)胞置于-196℃液氮中低溫保存，可以使細(xì)胞暫時(shí)脫離生長(zhǎng)狀態(tài)而將其細(xì)胞特性保存起來(lái)，這樣在需要的時(shí)候再?gòu)?fù)蘇細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。而且適度地保存一定量的細(xì)胞，可以防止因正在培養(yǎng)的細(xì)胞被污染或其他意外事件而使細(xì)胞丟種，起到了細(xì)胞保種的作用。

凍存技術(shù)要點(diǎn)是慢凍，標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序?yàn)榻禍厮俾?1～-2℃/ min；當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時(shí)，可增至-5℃～-10℃/min。我們常用的傳統(tǒng)方法是將凍存管置于4℃30分鐘--->-20℃60分鐘--->-80℃隔夜--->液氮罐。但是由于步驟較多，時(shí)間間隔較長(zhǎng)，很容易遺忘。但是任何一個(gè)步驟的拖延都會(huì)嚴(yán)重影響細(xì)胞存活。而市面上程序冷凍儀又價(jià)格昂貴，必要性也不高，不是每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都擁有的。

方法改進(jìn)：我們考慮到泡沫塑料有很好的保溫隔熱效果，同時(shí)又注意到我們購(gòu)買的BD公司的15ml離心管包裝里的泡沫塑料孔徑與凍存管相當(dāng)。我們改進(jìn)的凍存方法是：可將細(xì)胞凍存管放入泡沫支架中，再加蓋一塊同樣的泡沫支架后，直接放入-80℃冰箱隔夜后轉(zhuǎn)移進(jìn)液氮罐。該方法不但利用了廢物利于環(huán)保，而且省時(shí)省心，非常便捷有效。

慧穎生物熱賣細(xì)胞株細(xì)胞系：ATDC-5-EGFP細(xì)胞-小鼠軟骨細(xì)胞株；MC38細(xì)胞-小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞株；DC2.4細(xì)胞-小鼠樹突狀細(xì)胞株；L Wnt-3A細(xì)胞-小鼠皮下結(jié)締組織細(xì)胞株；MC3T3-E1細(xì)胞-小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞株；NIH/3T3細(xì)胞-小鼠胚胎成纖維細(xì)胞株；T24細(xì)胞-人膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞株；A2780/DDP細(xì)胞-人卵巢癌耐DDP細(xì)胞株；Hep G2細(xì)胞-人肝癌細(xì)胞株等。