單克隆抗體的制備、純化及鑒定

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/span>

單克隆抗體制備是細(xì)胞免疫學(xué)的一個(gè)重要里程碑，它涵蓋了細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞融合、免疫動(dòng)物和抗體效價(jià)檢測(cè)等各個(gè)方面內(nèi)容。了解單克隆抗體制備的原理、主要步驟和方法。

二、實(shí)驗(yàn)原理：

   骨髓瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)能大量無(wú)限增殖，但不能分泌特異性抗體；而抗原免疫的B淋巴細(xì)胞能產(chǎn)生特異性抗體，但在體外不能無(wú)限增殖。將免疫脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合后形成的雜交瘤細(xì)胞，繼承了兩個(gè)親代細(xì)胞的特性，既具有骨髓瘤細(xì)胞能無(wú)限制增殖的特性，又具有免疫B細(xì)胞合成和分泌特異性抗體的能力。經(jīng)在HAT培養(yǎng)基[含有次黃嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)]中進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，未融合的脾細(xì)胞因不能在體外長(zhǎng)期存活而死亡；未融合的骨髓瘤細(xì)胞合成DNA的主要途徑被培養(yǎng)基中的氨基蝶呤阻斷，又因缺乏次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT），不能利用培養(yǎng)基中的次黃嘌呤完成DNA的合成過(guò)程而死亡。只有融合的雜交瘤細(xì)胞由于從脾細(xì)胞獲得了次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，因此能在HAT培養(yǎng)基中存活和增殖。經(jīng)過(guò)克隆選擇，可篩選出能產(chǎn)生特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，在體內(nèi)或體外培養(yǎng)，即可無(wú)限制地大量制備單克隆抗體。

 三、試劑與器材：

細(xì)胞培養(yǎng)板、解剖器械、平皿、酶標(biāo)儀、加樣器、細(xì)胞計(jì)數(shù)板、CO2培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡等。

四、操作方法：

1、抗原制備；

一般而言，抗原的純度不很重要，特別是免疫原性較強(qiáng)的抗原。

A．可溶性抗原（蛋白質(zhì)） 以1mg/ml～5mg／ml的溶液加等量的弗氏*佐劑乳化，分多點(diǎn)小鼠皮下注射，總量為0.3ml～0.6ml，間隔３～５周再同樣注射一次，１０天后，斷尾取血一滴，測(cè)抗體效價(jià)，選滴度高的小鼠做融合試驗(yàn)。一個(gè)月后可以經(jīng)靜脈（尾靜脈）給予無(wú)佐劑抗原0.2ml～0.4ml，３～４天后，殺死小鼠取脾做融合用。

B. 顆粒性抗原 如抗原來(lái)源方便，可以不加佐劑而增加免疫次數(shù)，縮短間隔時(shí)間。例如用羊紅血球免疫小白鼠，以１％濃度每只皮下注射０.２ml，每周２次，共免疫５～８次，取脾前３天，再免疫一次即可。有人認(rèn)為zui后一次免疫劑量要大，大到近于免疫耐受的程度更好。

2、免疫動(dòng)物；

目前應(yīng)用zui廣的是小白鼠和大白鼠，尤以小白鼠為好。就品系而言以Balb/c小白鼠應(yīng)用zui廣，因?yàn)樗械男“资蠊撬枇鱿稻鶑腂alb/c小白鼠系誘導(dǎo)出來(lái)。Balb/c系小白鼠必須用純系的，雌雄均可，以8~12周齡為宜。

大白鼠也可，能產(chǎn)生較多量的單克隆抗體?，F(xiàn)在已經(jīng)在小鼠雜交瘤的基礎(chǔ)上，發(fā)展了小鼠－大鼠，小鼠－人以及人－人雜交瘤技術(shù)。

免疫程序、劑量和方法是關(guān)系到是否能得到所需要的單克隆抗體的關(guān)鍵之一。

正常小鼠脾臟含有能產(chǎn)生各種不同抗體的B淋巴細(xì)胞，一只純種小白鼠估計(jì)能產(chǎn)生1.0×107~5.0×107種不同的抗體。因此一只正常的小白鼠的脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤融合，只能有千萬(wàn)分之一的機(jī)會(huì)獲得某一種特定抗體。所以為了提高得到某種雜交瘤的機(jī)會(huì)，必須加強(qiáng)免疫，使產(chǎn)生特異性抗體的B淋巴細(xì)胞大量增加。

B淋巴細(xì)胞的不同發(fā)育階段對(duì)獲得陽(yáng)性雜交瘤也有很大影響。有人認(rèn)為處在轉(zhuǎn)化時(shí)期的B淋巴細(xì)胞可能更易于融合，而免疫以后7~8天，雖然是抗體產(chǎn)生的高峰時(shí)期，但形成有活力的雜交瘤細(xì)胞的可能反而減少。故一般認(rèn)為加強(qiáng)免疫后的第三天應(yīng)殺鼠取脾做細(xì)胞融合。

3、免疫脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的制備；

脾細(xì)胞制備

(1) 免疫過(guò)的血清抗體滴度高的Balb/c鼠，拉頸或用CO₂處死小白鼠。

(2) 將小鼠放于70％酒精中浸泡消毒，取出固定于板上，在無(wú)菌條件下取脾。

(3) 把脾放入5ml含有2.5％FCS的1640液中，冰浴下輕輕洗去脾上的紅血球。

(4) 用鑷子輕輕擠壓脾，做成脾細(xì)胞懸液，用毛細(xì)管將懸液移入小試管中。

(5) 直立小試管3min，使大塊的結(jié)締組織下沉，把細(xì)胞懸液移入離心管中。

(6) 以2.5％FCS—1640充滿(mǎn)離心管，并以400g離心7min～10min（與此同時(shí)應(yīng)開(kāi)始制備骨髓細(xì)胞）。

(7) 把沉淀用約10ml的新鮮培養(yǎng)液再懸浮。

(8) 重復(fù)⑹、⑺步驟。

(9) 計(jì)算細(xì)胞，以臺(tái)盼蘭染色用相差顯微鏡檢查，活細(xì)胞數(shù)應(yīng)高于80％為合格。

骨髓瘤細(xì)胞制備

骨髓瘤細(xì)胞能產(chǎn)生并分泌大量的免疫球蛋白，這樣的瘤細(xì)胞融合后，可能影響或降低所分泌抗體的滴度，所以必須選育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤細(xì)胞。

選擇骨髓瘤細(xì)胞的條件：①該瘤細(xì)胞系的來(lái)源應(yīng)與制備脾細(xì)胞小鼠為同一品系，以便兩者的組織相容性抗原一致；②骨髓瘤細(xì)胞必須是靜息狀態(tài)，不產(chǎn)生γ球蛋白或不分泌到細(xì)胞外；③骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)需要一個(gè)較高的細(xì)胞密度,106個(gè)細(xì)胞/ml；④生長(zhǎng)速度快，繁殖時(shí)間短。

目前常用的Balb/c小鼠產(chǎn)生的骨髓瘤細(xì)胞株有：①S194/5XXO·BU·1；②SP2／0—Ag14（簡(jiǎn)稱(chēng)SP2）；③P2—X？ ­—Ag8·6·5·3（簡(jiǎn)稱(chēng)653）；④FO

以653zui為常用，它是由礦物油4－甲基－15烷（Pristane，降植烷）誘發(fā)出來(lái)的一種漿細(xì)胞瘤（Minerol Oil plasmacy toma，MOPC）并經(jīng)過(guò)培育形成一株8-氮鳥(niǎo)嘌呤有抵抗力的亞系。

骨髓瘤細(xì)胞一般由有關(guān)單位直接引入，保存于-195℃液氮罐中，試驗(yàn)時(shí)復(fù)蘇、增殖、傳代即可。由于骨髓瘤細(xì)胞是半貼壁狀態(tài)，很容易脫落，因此不需要胰酶處理。為了防止出現(xiàn)返祖現(xiàn)象，在融合前，可將培養(yǎng)基內(nèi)加入15μg/ml 8－氮鳥(niǎo)嘌呤。取約1×10⁷～6×10⁷對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（即培養(yǎng)15h～20h）的骨髓瘤細(xì)胞，在室溫離心（400g）10min，沉淀以2.5％FCS—1640液再懸浮并計(jì)數(shù)。

飼養(yǎng)細(xì)胞

在體外的細(xì)胞培養(yǎng)中，單個(gè)的或數(shù)量很少的細(xì)胞不易生存與繁殖，必須加入其它活的細(xì)胞才能使其生長(zhǎng)繁殖，加入的細(xì)胞稱(chēng)之為飼養(yǎng)細(xì)胞（Feeder cell）。在細(xì)胞融合和單克隆的選擇過(guò)程中，就是在少量的或單個(gè)細(xì)胞的基礎(chǔ)上使其生長(zhǎng)繁殖成群體，因此在這一過(guò)程中必須使用飼養(yǎng)細(xì)胞。許多種類(lèi)的動(dòng)物細(xì)胞都可以做飼養(yǎng)細(xì)胞，如正常的脾細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、腹腔滲出細(xì)胞等，常選用腹腔滲出細(xì)胞，其中主要是巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。應(yīng)用腹腔滲出細(xì)胞的好處是：一方面做飼養(yǎng)細(xì)胞，另一方面巨噬細(xì)胞可以吞噬死亡的細(xì)胞和細(xì)胞碎片，為融合細(xì)胞的生長(zhǎng)造成良好的環(huán)境。腹腔細(xì)胞的來(lái)源可以是與骨髓瘤細(xì)胞同系鼠。也可以是其他種類(lèi)的小鼠，如C57鼠，昆明小白鼠等。

（1）拉頸處死小鼠。

（2）70％酒精浸泡消毒10min。

（3）用手術(shù)剪將小鼠腹部剪開(kāi)一小口，剝開(kāi)皮膚，露出腹腔。

（4）用注射器將4ml 11.6％蔗糖溶液注入腹腔，用手指輕揉1min仍用該注射器回抽腹腔液體，加入離心管。

（5）1 000r／min離心10min。

（6）取上清，以HAT選擇培養(yǎng)液將細(xì)胞制成懸液。臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞，使每毫升含40萬(wàn)個(gè)活細(xì)胞。

（7）以1ml吸管將細(xì)胞種入微量培養(yǎng)皿，每孔0.05ml，含2萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，即可供細(xì)胞融合和克隆化之用。如果在融合后發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)孔中飼養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量少，則可以在細(xì)胞換液時(shí)再加入一些。

4、細(xì)胞融合；

小鼠骨髓瘤可以在體外培養(yǎng)液中生存并大量繁殖。經(jīng)過(guò)用某種抗原免疫的小鼠及淋巴細(xì)胞能分泌某種抗體，但小鼠的B淋巴細(xì)胞在一般培養(yǎng)某中不易存活。

如將小鼠的骨髓瘤細(xì)胞與分泌霜種抗體的B淋巴細(xì)胞在融合因子（聚乙二醇，PEG）作用下產(chǎn)生融合，則融合的細(xì)胞既具有腫瘤細(xì)胞易分裂增殖的特性，又具有B淋巴細(xì)胞分泌特異性抗體的能力，在HAT選擇培養(yǎng)基中可以選擇得到雜交細(xì)胞。這種融合的被稱(chēng)為淋巴細(xì)胞雜交瘤的細(xì)胞可以在體外培養(yǎng)液中大量繁殖生長(zhǎng)，從培養(yǎng)液上清中可以收集到大量某B淋巴細(xì)胞產(chǎn)物——單克隆抗體。

（1）、取末次免疫后的第3天小鼠脾細(xì)胞懸液，將108小鼠脾細(xì)胞與1-5×107SO2/O小鼠骨髓瘤細(xì)胞混合于50毫升刻度離心管中，經(jīng)1000轉(zhuǎn)/分離心7分鐘；

（2）、棄上清液，盡可能除得干凈，用手指輕叩離心管底部，使沉淀混勻如糊狀，離心管置37℃水中進(jìn)行水?。ㄒ恍校?，準(zhǔn)備融合；

3）、將37℃水浴中保溫的50%PEG1.0毫升（實(shí)際應(yīng)用0.7毫升）用滴管緩慢滴入離心管中，在60秒鐘內(nèi)滴完，在37℃水浴中邊滴邊搖邊離心管，使細(xì)胞保存在混勻狀態(tài)；

4）、加完P(guān)EG后，將細(xì)胞懸液放在37℃水浴中靜置90秒鐘，立即在2—4分鐘內(nèi)加入15毫升無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)基（37℃），開(kāi)始要一滴一滴地加，由于稀釋使PEG停止作用。注意盡可能不攪動(dòng)細(xì)胞；

5）、再經(jīng)100轉(zhuǎn)/分離心10分鐘。棄去上清液，加25毫升HAT培養(yǎng)液，輕輕混勻，將混懸液分裝已有巨噬細(xì)胞的兩個(gè)24孔培養(yǎng)板中，每孔0.5毫升；

6）、將培養(yǎng)板放在水蒸汽飽和CO2孵箱中，37℃孵育。CO2含量為5%；

7）、每2—3天換一次HAT培養(yǎng)液，連續(xù)2周觀察雜交瘤細(xì)胞是否出現(xiàn)。2周后使用HT培養(yǎng)基。

5、雜交瘤細(xì)胞的選擇培養(yǎng)；

6、雜交瘤細(xì)胞的篩選；

7、雜交瘤細(xì)胞的克隆化；

8、單克隆抗體的檢定；

9、分泌單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞系的建立；

10、單克隆抗體的大量制備。

五、關(guān)鍵步驟與注意事項(xiàng)：

1、整個(gè)制備過(guò)程需嚴(yán)格無(wú)菌

2、細(xì)胞傳代培養(yǎng)時(shí)注意適時(shí)更換培養(yǎng)液

雜交瘤細(xì)胞的大量繁殖

克隆化的細(xì)胞可以在體外進(jìn)行大量培養(yǎng)，收集上清液而獲得大量的單一的克隆化抗體。不過(guò)體外培養(yǎng)法得到的單克隆抗體有限，其不能超過(guò)特定的細(xì)胞濃度，且每天要換培養(yǎng)液。而體內(nèi)雜交瘤細(xì)胞繁殖可以克服這些限制。雜交瘤細(xì)胞具有從親代淋巴細(xì)胞得來(lái)的腫瘤細(xì)胞的遺傳特性。如接種到組織相容性的同系小鼠或不能排斥雜交瘤的小鼠（無(wú)胸腺的裸鼠），雜交瘤細(xì)胞就開(kāi)始無(wú)限地繁殖，直至宿主死亡。產(chǎn)生腫瘤細(xì)胞的小鼠腹水和血清中含有大量的雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體，這種抗體的效價(jià)往往高于培養(yǎng)細(xì)胞上清液的100~1 000倍。

利用免疫抑制劑，如降植烷、液體石蠟、抗淋巴細(xì)胞血清等，可以加速和促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。

1．材料

　?。?）經(jīng)高壓滅菌的降植烷。

　　（2）Balb/c鼠：5~8周齡。

（3）雜交瘤細(xì)胞：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。

（4）RPMI—1640培養(yǎng)液

（5）新生牛血清

2．操作方法

　　(1) 于小鼠腹腔注射0.5ml降植烷，注射后１～９周內(nèi)種植細(xì)胞。

　　(2) 收取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞，用５％FCS—1640液洗滌一次，1 000r/min離心10min。

(3) 取樣，用臺(tái)盼蘭染色，計(jì)活細(xì)胞數(shù)，重新用５％FCS—1640液配成1.0×107細(xì)胞/ml的懸液。

(4) 給注射了降植烷的小白鼠接種雜交瘤細(xì)胞，每只腹腔注射1ml（含1.0×107個(gè)細(xì)胞/ml）。

(5) 接種后10天左右時(shí)間腫瘤體積zui大，此時(shí)可由腹腔抽取腹水，每隔1~3天取1次，可取10次。血清可由腋下動(dòng)脈或心臟采血后分離。

單克隆抗體的提純

1．材料

(1) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl緩沖液

20 mMol/L NaCl

(2) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl緩沖液

40mMol/L NaCl

(3) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl緩沖液

80 mMol/L NaCl

(4) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl緩沖液

(5) 飽和硫酸銨液

(6) DEAE—纖維素柱

2．操作方法

（1）小鼠腹水用冷PBS液稀釋4倍后，于1.00×105轉(zhuǎn)離心30min，去沉淀。

（2）在4℃于上清中緩緩滴加飽和硫酸銨液，邊加邊攪拌，使溶液zui終為50％硫酸銨濃度。

（3）此溶液置冰中30min~60min，然后5 000r/min離心10min，去上清。

（4）將沉淀溶于Tris－HCl緩沖液（40mMol/L NaCl）中（溶液可能混濁）。

（5）裝入透析袋于Tris－HCl緩沖液（20 mMol/L NaCl）中透析除鹽。

（6）離心去沉淀。

（7）溶液稀釋?zhuān)?:100或更高倍稀釋?zhuān)┖?，?80nm測(cè)蛋白含量，估計(jì)蛋白質(zhì)含量

1A 280unit=0.8mg蛋白質(zhì)

一般每ml腹水中，含有總蛋白約25mg~36mg。

（8）過(guò)DEAE—纖維素柱：纖維素柱高40cm，以20mMol/L NaCl Tris緩沖液平衡。透析樣品以Tris緩沖液等量稀釋。

樣品進(jìn)入柱床速度為1ml~2ml/min，以NaCl線(xiàn)形梯度洗脫。大部分單克隆IgG于40 mMol/L和80mMol/L NaCl洗脫，也有極少例外的單克隆抗體于120 mMol/L ~150 mMol/L NaCl洗脫。

測(cè)OD280nm收集蛋白峰，單克隆IgG保存?zhèn)溆谩?/span>

雜交瘤產(chǎn)生各種免疫球蛋白，但主要是IgG和IgM，究竟是哪種為主，則決定于抗原的免疫程序。免疫一次，且3天后就取脾，多為產(chǎn)生IgM的B淋巴細(xì)胞。免疫多次的多為IgG。

單克隆抗體的鑒定

1．雜交瘤細(xì)胞染色體的檢查 采用秋水仙素裂解法進(jìn)行。

2．單克隆抗體的類(lèi)型、亞型的測(cè)定：購(gòu)買(mǎi)兔抗小鼠Ig類(lèi)型和亞型的標(biāo)準(zhǔn)抗血清，采用瓊脂擴(kuò)散法或ELISA夾心法測(cè)定單抗的Ig類(lèi)型和亞型。

3．單抗的特異性鑒定 可以采用各種方法，如免疫熒光法、ELISA法、間接血凝和免疫印跡技術(shù)等，同時(shí)還需做免疫阻斷試驗(yàn)等。

4．單抗的效價(jià)測(cè)定 可采用凝集反應(yīng)、ELISA或放射免疫測(cè)定。不同的測(cè)定方法效價(jià)不同。培養(yǎng)上清液的效價(jià)遠(yuǎn)不如腹水的效價(jià)。采用凝集反應(yīng)，腹水效價(jià)可達(dá)5×104。而采用ELISA檢查，腹水效價(jià)可達(dá)1.0×106。單抗的效價(jià)以培養(yǎng)上清和腹水的稀釋度表示。

5．必要時(shí)還可以測(cè)定單抗的親和力和識(shí)別抗原表位的能力測(cè)定。

動(dòng)物的選擇

目前應(yīng)用zui廣的是小白鼠和大白鼠，尤以小白鼠為好。就品系而言以Balb/c小白鼠應(yīng)用zui廣，因?yàn)樗械男“资蠊撬枇鱿稻鶑腂alb/c小白鼠系誘導(dǎo)出來(lái)。Balb/c系小白鼠必須用純系的，雌雄均可，以8~12周齡為宜。

大白鼠也可，能產(chǎn)生較多量的單克隆抗體?，F(xiàn)在已經(jīng)在小鼠雜交瘤的基礎(chǔ)上，發(fā)展了小鼠－大鼠，小鼠－人以及人－人雜交瘤技術(shù)。

免疫

一般而言，抗原的純度不很重要，特別是免疫原性較強(qiáng)的抗原。

免疫程序、劑量和方法是關(guān)系到是否能得到所需要的單克隆抗體的關(guān)鍵之一。

正常小鼠脾臟含有能產(chǎn)生各種不同抗體的B淋巴細(xì)胞，一只純種小白鼠估計(jì)能產(chǎn)生1.0×10⁷~5.0×10⁷種不同的抗體。因此一只正常的小白鼠的脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤融合，只能有千萬(wàn)分之一的機(jī)會(huì)獲得某一種特定抗體。所以為了提高得到某種雜交瘤的機(jī)會(huì)，必須加強(qiáng)免疫，使產(chǎn)生特異性抗體的B淋巴細(xì)胞大量增加。

B淋巴細(xì)胞的不同發(fā)育階段對(duì)獲得陽(yáng)性雜交瘤也有很大影響。有人認(rèn)為處在轉(zhuǎn)化時(shí)期的B淋巴細(xì)胞可能更易于融合，而免疫以后7~8天，雖然是抗體產(chǎn)生的高峰時(shí)期，但形成有活力的雜交瘤細(xì)胞的可能反而減少。故一般認(rèn)為加強(qiáng)免疫后的第三天應(yīng)殺鼠取脾做細(xì)胞融合。

1．可溶性抗原（蛋白質(zhì)） 以1mg/ml～5mg／ml的溶液加等量的弗氏*佐劑乳化，分多點(diǎn)小鼠皮下注射，總量為0.3ml～0.6ml，間隔３～５周再同樣注射一次，１０天后，斷尾取血一滴，測(cè)抗體效價(jià)，選滴度高的小鼠做融合試驗(yàn)。一個(gè)月后可以經(jīng)靜脈（尾靜脈）給予無(wú)佐劑抗原0.2ml～0.4ml，３～４天后，殺死小鼠取脾做融合用。

２.顆粒性抗原 如抗原來(lái)源方便，可以不加佐劑而增加免疫次數(shù)，縮短間隔時(shí)間。例如用羊紅血球免疫小白鼠，以１％濃度每只皮下注射０.２ml，每周２次，共免疫５～８次，取脾前３天，再免疫一次即可。有人認(rèn)為zui后一次免疫劑量要大，大到近于免疫耐受的程度更好。

單克隆抗體技術(shù)：細(xì)胞的選擇

脾細(xì)胞

1．材料

(1) 免疫過(guò)的血清抗體滴度高的Balb/c鼠。

(2) 1640培養(yǎng)液

(3) 2.5％FCS－1640營(yíng)養(yǎng)液

2．操作方法

(1) 拉頸或用CO2處死小白鼠。

(2) 將小鼠放于70％酒精中浸泡消毒，取出固定于板上，在無(wú)菌條件下取脾。

(3) 把脾放入5ml含有2.5％FCS的1640液中，冰浴下輕輕洗去脾上的紅血球。

(4) 用鑷子輕輕擠壓脾，做成脾細(xì)胞懸液，用毛細(xì)管將懸液移入小試管中。

(5) 直立小試管3min，使大塊的結(jié)締組織下沉，把細(xì)胞懸液移入離心管中。

(6) 以2.5％FCS—1640充滿(mǎn)離心管，并以400g離心7min～10min（與此同時(shí)應(yīng)開(kāi)始制備骨髓細(xì)胞）。

(7) 把沉淀用約10ml的新鮮培養(yǎng)液再懸浮。

(8) 重復(fù)⑹、⑺步驟。

(9) 計(jì)算細(xì)胞，以臺(tái)盼蘭染色用相差顯微鏡檢查，活細(xì)胞數(shù)應(yīng)高于80％為合格。

骨髓瘤細(xì)胞

骨髓瘤細(xì)胞能產(chǎn)生并分泌大量的免疫球蛋白，這樣的瘤細(xì)胞融合后，可能影響或降低所分泌抗體的滴度，所以必須選育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤細(xì)胞。

選擇骨髓瘤細(xì)胞的條件：①該瘤細(xì)胞系的來(lái)源應(yīng)與制備脾細(xì)胞小鼠為同一品系，以便兩者的組織相容性抗原一致；②骨髓瘤細(xì)胞必須是靜息狀態(tài)，不產(chǎn)生γ球蛋白或不分泌到細(xì)胞外；③骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)需要一個(gè)較高的細(xì)胞密度,106個(gè)細(xì)胞/ml；④生長(zhǎng)速度快，繁殖時(shí)間短。

目前常用的Balb/c小鼠產(chǎn)生的骨髓瘤細(xì)胞株有：①S194/5XXO·BU·1；②SP2／0—Ag14（簡(jiǎn)稱(chēng)SP2）；③P2—X？ ­—Ag8·6·5·3（簡(jiǎn)稱(chēng)653）；④FO

以653zui為常用，它是由礦物油4－甲基－15烷（Pristane，降植烷）誘發(fā)出來(lái)的一種漿細(xì)胞瘤（Minerol Oil plasmacy toma，MOPC）并經(jīng)過(guò)培育形成一株8-氮鳥(niǎo)嘌呤有抵抗力的亞系。

骨髓瘤細(xì)胞一般由有關(guān)單位直接引入，保存于-195℃液氮罐中，試驗(yàn)時(shí)復(fù)蘇、增殖、傳代即可。

由于骨髓瘤細(xì)胞是半貼壁狀態(tài)，很容易脫落，因此不需要胰酶處理。為了防止出現(xiàn)返祖現(xiàn)象，在融合前，可將培養(yǎng)基內(nèi)加入15μg/ml 8－氮鳥(niǎo)嘌呤。取約1×107～6×107對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（即培養(yǎng)15h～20h）的骨髓瘤細(xì)胞，在室溫離心（400g）10min，沉淀以2.5％FCS—1640液再懸浮并計(jì)數(shù)。

飼養(yǎng)細(xì)胞

在體外的細(xì)胞培養(yǎng)中，單個(gè)的或數(shù)量很少的細(xì)胞不易生存與繁殖，必須加入其它活的細(xì)胞才能使其生長(zhǎng)繁殖，加入的細(xì)胞稱(chēng)之為飼養(yǎng)細(xì)胞（Feeder cell）。在細(xì)胞融合和單克隆的選擇過(guò)程中，就是在少量的或單個(gè)細(xì)胞的基礎(chǔ)上使其生長(zhǎng)繁殖成群體，因此在這一過(guò)程中必須使用飼養(yǎng)細(xì)胞。許多種類(lèi)的動(dòng)物細(xì)胞都可以做飼養(yǎng)細(xì)胞，如正常的脾細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、腹腔滲出細(xì)胞等，常選用腹腔滲出細(xì)胞，其中主要是巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。應(yīng)用腹腔滲出細(xì)胞的好處是：一方面做飼養(yǎng)細(xì)胞，另一方面巨噬細(xì)胞可以吞噬死亡的細(xì)胞和細(xì)胞碎片，為融合細(xì)胞的生長(zhǎng)造成良好的環(huán)境。腹腔細(xì)胞的來(lái)源可以是與骨髓瘤細(xì)胞同系鼠。也可以是其他種類(lèi)的小鼠，如C57鼠，昆明小白鼠等。

1．材料

（1）小鼠（Balb/c或C57小白鼠）若干只。

（2）11.6％蔗糖溶液（經(jīng)10磅30min高壓滅菌）。

2．操作方法

（1）拉頸處死小鼠。

（2）70％酒精浸泡消毒10min。

（3）用手術(shù)剪將小鼠腹部剪開(kāi)一小口，剝開(kāi)皮膚，露出腹腔。

（4）用注射器將4ml 11.6％蔗糖溶液注入腹腔，用手指輕揉1min仍用該注射器回抽腹腔液體，加入離心管。

（5）1 000r／min離心10min。

（6）取上清，以HAT選擇培養(yǎng)液將細(xì)胞制成懸液。臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞，使每毫升含40萬(wàn)個(gè)活細(xì)胞。

（7）以1ml吸管將細(xì)胞種入微量培養(yǎng)皿，每孔0.05ml，含2萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，即可供細(xì)胞融合和克隆化之用。如果在融合后發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)孔中飼養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量少，則可以在細(xì)胞換液時(shí)再加入一些。

單克隆抗體技術(shù)：抗體檢測(cè)

用檢測(cè)抗體的方法從雜交細(xì)胞中篩選出生產(chǎn)抗體的雜交株是很重要的。檢測(cè)抗體的方法很多，從沉淀反應(yīng)到放射免疫測(cè)定。由于細(xì)胞培養(yǎng)液中的抗體濃度通常是很低的，而且傳統(tǒng)的檢測(cè)方法多是以多價(jià)抗原與多克隆抗血清相反應(yīng)。雜交瘤產(chǎn)生的抗體則是單克隆的，所以并不是每項(xiàng)方法都能適用。一定要選擇敏感的、快速的、一次又能檢測(cè)多份樣品的方法。常用的檢測(cè)方法如下：

１．試管溶血反應(yīng)檢測(cè)法

（1）材料：①雜交瘤細(xì)胞，換液后至少兩天才收取培養(yǎng)液；②綿羊紅血球，洗滌三次后，配成1％懸液；③豚鼠補(bǔ)體，無(wú)菌采取補(bǔ)體，以pH7.2PBS稀釋成20％溶液，分裝小瓶，于﹣40℃保存。使用時(shí)以補(bǔ)體和壓積紅血球5:1（V/V）的量進(jìn)行吸收，4℃30min，然后2 000r/min離心10min，去紅血球，取上清液備用；④0.01Mol/L pH7.2PBS液。

（2）操作方法：①在小試管中，加入0.1ml雜交瘤細(xì)胞用過(guò)的培養(yǎng)液，再加入0.1ml pH7.2的PBS液，然后倍比稀釋至一定的稀釋度；②加入0.1ml補(bǔ)體和1％綿羊紅血球0.1ml，混勻后置37℃水浴1h；③觀察結(jié)果，以綿羊紅血球*溶解的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)液的zui高稀釋倍數(shù)為抗體的溶血效價(jià)。

2．斑點(diǎn)檢測(cè)法 抗紅血球表面的單克隆抗體與澆灌在瓊脂板的紅血球結(jié)合，進(jìn)而結(jié)合補(bǔ)體，而發(fā)生溶血斑點(diǎn)，對(duì)著光源用肉眼即可判定。

（1）材料：①綿羊紅血球，處理同試管法，zui后配成25％紅血球懸液；②新鮮豚鼠血清（同試管法處理）；③瓊脂糖，配成0.6％PBS液，水浴中溶化；④0.01Mol/L pH7.2PBS液；⑤兔抗羊紅血球抗體。

（2）操作方法：①將溶化的0.6％瓊脂糖倒入一試管中，置45℃～48℃水浴中；②加0.1ml 25％紅血球懸液，0.1ml豚鼠補(bǔ)體，迅速混勻，傾注一干凈載玻片上；③ 凝固后，在凝膠表面固定區(qū)域滴加2ml待測(cè)樣品，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和對(duì)照試液；④待溶液全部滲入凝膠后，置濕盤(pán)；⑤37℃溫育1h～2h，觀察并判定結(jié)果。

強(qiáng)陽(yáng)性（ ） 中等陽(yáng)性（ ）

弱陽(yáng)性（ ） 陰性（﹣）

必要時(shí)可置室溫一夜，再判定一次。

3．膜熒光檢測(cè)法

（1）材料：①培養(yǎng)液HEM或RPMI－1640；②熒光試劑：異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的抗小鼠免疫球蛋白；③50％甘油緩沖液：1份甘油加1份體積0.05Mol/L pH 7.2 PBS 液混合即成；④熒光顯微鏡、載玻片、蓋玻片、吸管等。

（2）操作方法：①用培養(yǎng)液洗滌二次細(xì)胞，懸浮成2.0×107／ml；②50µl細(xì)胞懸液加50μl培養(yǎng)上清液混合，置4℃30min，用培養(yǎng)液洗滌3次，1 000r/min離心；③以50µlFITC—抗小鼠免疫球蛋白重新懸浮壓積細(xì)胞，水浴30min～60min；④用冷培養(yǎng)液洗3次細(xì)胞，重新懸??；⑤取一滴細(xì)胞懸液滴在玻片上，復(fù)蓋片，用甘油緩沖液封固，置熒光顯微鏡下觀察。著色細(xì)胞也可以在固定后觀察，一滴細(xì)胞懸液，涂片、風(fēng)干，用95％酒精固定10min，固定后的載玻片用PBS洗滌，蓋上蓋玻片，進(jìn)行觀察。

4．免疫球蛋白和亞類(lèi)球蛋白的檢測(cè) 以瓊脂雙擴(kuò)散試驗(yàn)法進(jìn)行，此法簡(jiǎn)單易操作，特異性好。注意必須將培養(yǎng)液濃縮10～50倍，否則做雙向瓊擴(kuò)不出現(xiàn)沉淀線(xiàn)。其檢測(cè)方法為：

（1）制備各種兔抗小鼠IgG1~4、 IgM1~2、IgA1~2和K、λ抗血清,也可直接購(gòu)買(mǎi)。

（2）取5ml培養(yǎng)物的上清液緩慢加入0.5ml的飽和硫酸銨溶液，混勻，靜置3h，離心沉淀，去上清，沉淀加0.05ml蒸餾水溶解。

（3）制成1％瓊脂糖凝膠板，打孔。中間孔加20μl濃縮上清液，周?chē)准?0µl特異性抗血清，以10μl正常小鼠血清作對(duì)照。

也可以采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、間接血凝試驗(yàn)以及放射免疫等方法檢測(cè)。

單克隆抗體的制備

雜交瘤細(xì)胞的大量繁殖

克隆化的細(xì)胞可以在體外進(jìn)行大量培養(yǎng)，收集上清液而獲得大量的單一的克隆化抗體。不過(guò)體外培養(yǎng)法得到的單克隆抗體有限，其不能超過(guò)特定的細(xì)胞濃度，且每天要換培養(yǎng)液。而體內(nèi)雜交瘤細(xì)胞繁殖可以克服這些限制。雜交瘤細(xì)胞具有從親代淋巴細(xì)胞得來(lái)的腫瘤細(xì)胞的遺傳特性。如接種到組織相容性的同系小鼠或不能排斥雜交瘤的小鼠（無(wú)胸腺的裸鼠），雜交瘤細(xì)胞就開(kāi)始無(wú)限地繁殖，直至宿主死亡。產(chǎn)生腫瘤細(xì)胞的小鼠腹水和血清中含有大量的雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體，這種抗體的效價(jià)往往高于培養(yǎng)細(xì)胞上清液的100~1 000倍。

利用免疫抑制劑，如降植烷、液體石蠟、抗淋巴細(xì)胞血清等，可以加速和促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。

1．材料

　?。?）經(jīng)高壓滅菌的降植烷。

　?。?）Balb/c鼠：5~8周齡。

（3）雜交瘤細(xì)胞：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。

（4）RPMI—1640培養(yǎng)液

（5）新生牛血清

2．操作方法

　　(1) 于小鼠腹腔注射0.5ml降植烷，注射后１～９周內(nèi)種植細(xì)胞。

　　(2) 收取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞，用５％FCS—1640液洗滌一次，1 000r/min離心10min。

(3) 取樣，用臺(tái)盼蘭染色，計(jì)活細(xì)胞數(shù)，重新用５％FCS—1640液配成1.0×107細(xì)胞/ml的懸液。

(4) 給注射了降植烷的小白鼠接種雜交瘤細(xì)胞，每只腹腔注射1ml（含1.0×107個(gè)細(xì)胞/ml）。

(5) 接種后10天左右時(shí)間腫瘤體積zui大，此時(shí)可由腹腔抽取腹水，每隔1~3天取1次，可取10次。血清可由腋下動(dòng)脈或心臟采血后分離。

單克隆抗體的提純

1．材料

(1) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl緩沖液

20 mMol/L NaCl

(2) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl緩沖液

40mMol/L NaCl

(3) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl緩沖液

80 mMol/L NaCl

(4) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl緩沖液

(5) 飽和硫酸銨液

(6) DEAE—纖維素柱

2．操作方法

（1）小鼠腹水用冷PBS液稀釋4倍后，于1.00×105轉(zhuǎn)離心30min，去沉淀。

（2）在4℃于上清中緩緩滴加飽和硫酸銨液，邊加邊攪拌，使溶液zui終為50％硫酸銨濃度。

（3）此溶液置冰中30min~60min，然后5 000r/min離心10min，去上清。

（4）將沉淀溶于Tris－HCl緩沖液（40mMol/L NaCl）中（溶液可能混濁）。

（5）裝入透析袋于Tris－HCl緩沖液（20 mMol/L NaCl）中透析除鹽。

（6）離心去沉淀。

（7）溶液稀釋?zhuān)?:100或更高倍稀釋?zhuān)┖?，?80nm測(cè)蛋白含量，估計(jì)蛋白質(zhì)含量

1A 280unit=0.8mg蛋白質(zhì)

一般每ml腹水中，含有總蛋白約25mg~36mg。

（8）過(guò)DEAE—纖維素柱：纖維素柱高40cm，以20mMol/L NaCl Tris緩沖液平衡。透析樣品以Tris緩沖液等量稀釋。

樣品進(jìn)入柱床速度為1ml~2ml/min，以NaCl線(xiàn)形梯度洗脫。大部分單克隆IgG于40 mMol/L和80mMol/L NaCl洗脫，也有極少例外的單克隆抗體于120 mMol/L ~150 mMol/L NaCl洗脫。

測(cè)OD280nm收集蛋白峰，單克隆IgG保存?zhèn)溆谩?/span>

雜交瘤產(chǎn)生各種免疫球蛋白，但主要是IgG和IgM，究竟是哪種為主，則決定于抗原的免疫程序。免疫一次，且3天后就取脾，多為產(chǎn)生IgM的B淋巴細(xì)胞。免疫多次的多為IgG。

單克隆抗體的鑒定

1．雜交瘤細(xì)胞染色體的檢查 采用秋水仙素裂解法進(jìn)行。

2．單克隆抗體的類(lèi)型、亞型的測(cè)定：購(gòu)買(mǎi)兔抗小鼠Ig類(lèi)型和亞型的標(biāo)準(zhǔn)抗血清，采用瓊脂擴(kuò)散法或ELISA夾心法測(cè)定單抗的Ig類(lèi)型和亞型。

3．單抗的特異性鑒定 可以采用各種方法，如免疫熒光法、ELISA法、間接血凝和免疫印跡技術(shù)等，同時(shí)還需做免疫阻斷試驗(yàn)等。

4．單抗的效價(jià)測(cè)定 可采用凝集反應(yīng)、ELISA或放射免疫測(cè)定。不同的測(cè)定方法效價(jià)不同。培養(yǎng)上清液的效價(jià)遠(yuǎn)不如腹水的效價(jià)。采用凝集反應(yīng)，腹水效價(jià)可達(dá)5×104。而采用ELISA檢查，腹水效價(jià)可達(dá)1.0×106。單抗的效價(jià)以培養(yǎng)上清和腹水的稀釋度表示。

5．必要時(shí)還可以測(cè)定單抗的親和力和識(shí)別抗原表位的能力測(cè)定。

單克隆抗體技術(shù)：克隆化經(jīng)過(guò)抗體測(cè)定的陽(yáng)性孔，可以擴(kuò)大培養(yǎng)，進(jìn)行克隆，以得到單個(gè)細(xì)胞的后代分泌單克隆抗體。克隆的時(shí)間一般說(shuō)來(lái)越早越好。因?yàn)樵谶@個(gè)時(shí)期各種雜交瘤細(xì)胞同時(shí)旺盛生長(zhǎng)，互相爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)和空間，而產(chǎn)生抗體的細(xì)胞有被淹沒(méi)和淘汰的可能。但克隆時(shí)間也不宜太早，太早細(xì)胞性狀不穩(wěn)定，數(shù)量少也易丟失。

克隆化的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)過(guò)一段時(shí)期培養(yǎng)之后，也還會(huì)因?yàn)榧?xì)胞突變或特定染色體的丟失，使部分細(xì)胞喪失產(chǎn)生抗體的能力，所以需要再次或多次克隆化培養(yǎng)。克隆化次數(shù)的多少由分泌能力強(qiáng)弱和抗原的免疫性強(qiáng)弱而決定。一般說(shuō)，免疫性強(qiáng)的抗原克隆次數(shù)可少一些，但至少要3～5次克隆才能穩(wěn)定。

克隆化的方法很多，包括有限稀釋法、顯微操作法、軟瓊脂平板法及熒光激活分離法等。

有限稀釋法

1．材料

（1）微量培養(yǎng)盤(pán)，盤(pán)內(nèi)各孔于克隆化前一天培養(yǎng)小鼠腹腔細(xì)胞（即飼養(yǎng)細(xì)胞）每孔2萬(wàn)～4萬(wàn)。

（2）HT培養(yǎng)基

2．操作方法

（1）取出抗體陽(yáng)性孔細(xì)胞，用HT培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液。并取樣進(jìn)行臺(tái)盼蘭染色，計(jì)數(shù)。

（2）用HT培養(yǎng)液將細(xì)胞稀釋成200個(gè)/ml、40個(gè)/ml、20個(gè)/ml和的懸液。

（3）用吸管將細(xì)胞懸液分別種入微量培養(yǎng)盤(pán)，每孔0.05ml，細(xì)胞含量分別為10個(gè)/孔、2個(gè)/孔、1個(gè)/孔和0.5個(gè)/孔。

（4）5％CO2飽和濕度，37℃培養(yǎng)。

（5）每天用倒置顯微鏡觀察克隆生長(zhǎng)情況，選擇只有一個(gè)集落生長(zhǎng)的孔，棄掉兩個(gè)以上和沒(méi)有細(xì)胞生長(zhǎng)的孔。

（6）克隆大量繁殖后，布滿(mǎn)孔底的1/3～1/2時(shí)，測(cè)培養(yǎng)液抗體。

（7）抗體陽(yáng)性孔細(xì)胞，移到有飼養(yǎng)層的組織培養(yǎng)瓶中，并傳2～4代就可以脫離飼養(yǎng)細(xì)胞，建成克隆株