微生物實(shí)驗(yàn)用菌種是進(jìn)行新產(chǎn)品研發(fā)和生產(chǎn)質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。為了保證微生物實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確靈敏和人員及環(huán)境的衛(wèi)生安全，特制定以下規(guī)定：

1. 菌種采集。實(shí)驗(yàn)室用菌種一是到國(guó)家法定機(jī)構(gòu)采購(gòu)，二是購(gòu)買ATCC菌種（原代或國(guó)內(nèi)傳代），三是科研中菌種交流。不管是哪種來(lái)源，均由公司統(tǒng)一采集。采集中嚴(yán)格按照規(guī)范執(zhí)行。要求包裝可靠，采集迅速，不泄漏不污染。保證菌種合格和環(huán)境安全。采集中要有菌種傳代標(biāo)識(shí)。

2.菌種的活化：購(gòu)買的標(biāo)準(zhǔn)菌種必須要求是凍干粉，科研中菌種交流可以為斜面或液體。

菌種的活化是在非選擇性瓊脂培養(yǎng)基上，除非特殊情況或特別推薦，一般不用液體培養(yǎng)基。具體使用培養(yǎng)基的情況如下表，詳細(xì)菌種使用方法見(jiàn)附表：

方  法        培養(yǎng)基

方法1        胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA），非選擇性羊血瓊脂，PCA或營(yíng)養(yǎng)瓊脂，35℃正常環(huán)境培養(yǎng)24-48小時(shí)。

方法2        非選擇性羊血瓊脂，35℃正常環(huán)境培養(yǎng)24-48小時(shí)。

方法3        巧克力瓊脂平板，35℃5-10%CO2環(huán)境培養(yǎng)24-48小時(shí)。

方法4        CDC厭氧血瓊脂35℃厭氧培養(yǎng)48-72小時(shí)；部分專性厭氧菌能需要5-7天，才能充分生長(zhǎng)；對(duì)于梭菌，以下新鮮培養(yǎng)基也可選用：營(yíng)養(yǎng)瓊脂，TSA瓊脂，PCA瓊脂，需培養(yǎng)48-96小時(shí)。

方法5        沙堡氏葡萄糖Emmons瓊脂25-28℃培養(yǎng)3-7天；也可用PDA瓊脂。

方法6        巧克力瓊脂平板，35℃微需氧環(huán)境培養(yǎng)48-72小時(shí)。

方法7        改良羅氏瓊脂或Middlebrook瓊脂，35℃5-10%CO2或正常環(huán)境培養(yǎng)7天。

方法8        緩沖活性碳酵母提取物瓊脂，35℃正常環(huán)境培養(yǎng)3-5天。

方法9        巧克力瓊脂平板，35℃5-10%CO2環(huán)境培養(yǎng)48小時(shí)。

方法10        先用腦心浸出液肉湯或TSB培養(yǎng)基35℃增菌培養(yǎng)18-24小時(shí)，再劃線至TSA瓊脂35℃正常環(huán)境培養(yǎng)24-48小時(shí)。

方法11        先接種于MRS肉湯35℃增菌培養(yǎng)24-48小時(shí)，再劃線接種至含羊血的哥倫比亞CNA培養(yǎng)基35℃5%CO2環(huán)境培養(yǎng)24-48小時(shí)。

方法12        PDA瓊脂45℃正常環(huán)境培養(yǎng)48-72小時(shí)。

方法13        先接種于10B精氨酸肉湯，作系列梯度稀釋35℃正常培養(yǎng)至培養(yǎng)基變成粉紅色，接入A-8瓊脂。

3.菌種保存。所有菌種均由實(shí)驗(yàn)室專人（雙人雙鎖）保存于冰箱或其它保存方式。要建立菌種登記臺(tái)帳，詳細(xì)記錄菌種采集、保管、制備、使用、處置情況；每一種菌種一定要有本公司的檢測(cè)鑒定報(bào)告（具體的的鑒定方法見(jiàn)ATCC提供的菌種證書(shū)方法）；具體菌種保存方法如下：

3.1 干粉菌種：購(gòu)買的干粉菌種保存于2-8℃冰箱中，可保存3-5年。

3.2 斜面菌種或液體菌種：

3.2.1 液氮罐保存方法：用于*代菌種的長(zhǎng)期保存，每種菌種保存5管。

（1）準(zhǔn)備用于液氮保藏的安瓿管或菌種保存管（塑料），要求能耐受溫度突然變化而不致破裂，因此，需要采用硼硅酸鹽玻璃制造的安瓿管，安瓿管的大小通常使用75×10mm的，或能容1．2mm液體的。

　　（2）加保護(hù)劑與滅菌保存細(xì)菌、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的細(xì)胞時(shí)，則將空安瓿管塞上棉塞， 121℃滅菌15分鐘：若作保存霉菌菌絲體用則需在安瓿管內(nèi)預(yù)先加入保護(hù)劑如10％的甘油蒸餾水溶液或10％二甲亞砜蒸餾水溶液，加入量以能浸沒(méi)以后加入的菌落圓塊為限，而后再用121℃滅菌15分鐘。

　　（3）接入菌種：將菌種用10％的甘油蒸餾水溶液制成菌懸液，裝入已滅菌的安瓿管；霉菌菌絲體則可用滅菌打孔器，從平板內(nèi)切取菌落圓塊，放入含有保護(hù)劑的安瓿管內(nèi)，然后用火焰熔封。浸入水中檢查有無(wú)漏洞。

　?。?）凍結(jié)再將已封口的安瓿管以每分鐘下降1℃的慢速凍結(jié)至-30℃。若細(xì)胞急劇冷凍，則在細(xì)胞內(nèi)會(huì)形成冰的結(jié)晶，因而降低存活率。

　　（5）保藏經(jīng)凍結(jié)至-30℃的安瓿管立即放入液氮冷凍保藏器的小圓筒內(nèi)，然后再將小圓筒放入液氮保藏器內(nèi)。液氮保藏器內(nèi)的氣相為-150℃，液態(tài)氮內(nèi)為-196℃。

　　（6）恢復(fù)培養(yǎng)保藏的菌種需要用時(shí)，將安瓿管取出，立即放入38-40℃的水浴中進(jìn)行急劇解凍，直到全部融化為止。再打開(kāi)安瓿管，將內(nèi)容物移入適宜的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

　　此法除適宜于一般微生物的保藏外，對(duì)一些用冷凍干燥法都難以保存的微生物如支原體、衣原體、氫細(xì)菌、難以形成孢子的霉菌、噬菌體及動(dòng)物細(xì)胞均可長(zhǎng)期保藏，而且性狀不變異。

3.2.2 液體石蠟保存法：將液體石蠟分裝于三角燒瓶?jī)?nèi)，塞上棉塞，并用牛皮紙包扎， 121℃滅菌30分鐘，然后放在40℃溫箱中，使水汽蒸發(fā)掉，備用。將需要保藏的菌種，在zui適宜的斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使得到健壯的菌體或孢子。用滅菌吸管吸取滅菌的液體石蠟，注入已長(zhǎng)好菌的斜面上，其用量以高出斜面頂端1cm為準(zhǔn)，使菌種與空氣隔絕。將試管直立，置低溫或室溫下保存（有的微生物在室溫下比冰箱中保存的時(shí)間還要長(zhǎng)）。

1）大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、假單胞桿菌屬、沙門氏菌屬、副傷寒沙門氏菌、李斯特氏菌屬、蠟樣芽胞桿菌、八疊球菌、短芽孢桿菌、大腸桿菌HB101、大腸桿菌DH、豬肺疫、禽多殺性巴氏桿菌（禽霍亂）、豬丹毒、大腸桿菌O157、大腸菌群、產(chǎn)氣腸桿菌、志賀氏菌屬；接種于半固體培養(yǎng)基上，36±1℃培養(yǎng)18-24小時(shí)，加入無(wú)菌石蠟油覆蓋，保存于2-8℃冰箱或室溫中。可保存1-2年。

注：副溶血性弧菌接種于含鹽的半固體培養(yǎng)基上，36±1℃培養(yǎng)18-24小時(shí)，加入無(wú)菌石蠟油覆蓋，保存于室溫。

2）產(chǎn)氣莢膜梭菌、梭桿菌屬、擬桿菌屬等厭氧菌、厭氧消化鏈球菌：接種于CDC厭氧菌瓊脂中，培養(yǎng)18-24小時(shí)，加入無(wú)菌石蠟油覆蓋，保存于2-8℃冰箱或室溫中?？杀４?-2年。

3）酵母菌：接種于YPD培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)24-48小時(shí)，加入無(wú)菌石蠟油覆蓋，保存于2-8℃冰箱或室溫中?？杀４?-2年。

4）霉菌、白色念珠球菌：接種于PDA培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)24-48小時(shí)，加入無(wú)菌石蠟油覆蓋，保存于2-8℃冰箱或室溫中?？杀４?-2年。

5）鏈球菌屬：接種于羊血瓊脂，36±1℃培養(yǎng)24-48小時(shí)，加入無(wú)菌石蠟油覆蓋，保存于2-8℃冰箱或室溫中。可保存1-2年。

6）副嗜血桿菌、淋病奈瑟菌（需5-10%CO2環(huán)境）、腦膜炎奈瑟菌（需5-10%CO2環(huán)境）、流感嗜血桿菌接種于巧克力瓊脂，36±1℃培養(yǎng)24-48小時(shí)，加入無(wú)菌石蠟油覆蓋，保存于2-8℃冰箱或室溫中?？杀４?-2年。

7）分枝桿菌屬：接種于改良羅氏瓊脂或Middlebrook瓊脂36±1℃培養(yǎng)7天，加入無(wú)菌石蠟油覆蓋，保存于2-8℃冰箱或室溫中?？杀４?-2年。

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